En otro artículo de este blog di unas primeras pinceladas al macro extremo, en particular a los problemas de profundidad de campo que plantea y a la influencia de la difracción. Lo que nos obligaba a elegir entre cerrar diafragma o mejorar definición… o, lo que nos resultaba, que para tener una buena imagen sacrificábamos profundidad de campo y había que recurrir a las tomas por capas y el apilado (¡Demos gracias a los Dioses que vivimos en la era digital! Este proceso con película resultaba prácticamente imposible, por eso se recurría a las correcciones de Scheimpflug)
Vamos ahora a estudiar, muy simplificadamente, los problemas de la microscopía, empezando por un paralelismo entre cámara adaptada a macro, con fuelle, y el microscopio óptico.
Si observamos las figuras, la formación de imagen es bastante similar en ambos instrumentos. En el caso de la cámara usada en macro tenemos un objetivo, en realidad un juego de lentes positivas que se pueden simplificar a una sola. Para el microscopio se da la misma realidad, un objetivo de lentes positivas.
En la cámara macro nos conformamos con nuestro objetivo y un fuelle y pasamos directamente a tomar la foto, sea con película o con sensor. En macro usaremos objetivos de entre 50 y 100 mm de distancia focal y fotografiaremos objetos de bastantes milímetros, normalmente casi tan grandes como el sensor, con lo que solemos hacer tomas entre x0.5 y x5, a veces se puede llegar a x10. Lo típico, insectos, semillas, partes de la flor, etc.
En el microscopio somos más ambiciosos, para empezar podemos comenzar por ampliaciones x40 o x100, son normales x200 y hasta x400. Para conseguir imágenes tan ampliadas se suelen usar objetivos de escasos 10 mm o menos. No se usa fuelle, se construye un sistema sólido, con todas las partes roscadas y solidarias, perfectamente mecanizadas. El fuelle de la cámara macro es equivalente al cuerpo del microscopio. Además, no nos conformamos con la imagen que nos da el objetivo, en el microscopio ampliamos esta imagen con otra lente de aumento, el ocular.
Ahora es interesante repasar como se forma la imagen en una lente. Recordando aquella física de bachiller, hacíamos la composición de la figura y nos salía la imagen invertida.
En fotografía “normal”, el objeto está muy lejos del foco de la lente, para un objetivo de 50 mm, que el objeto esté a 15 m o en el infinito nos forma las dos imágenes muy cerca una de la otra. Luego, si recordamos aquello de los círculos de confusión, es relativamente fácil conseguir una profundidad de campo digamos que “cómoda”.
Cuando llegábamos al macro extremo vimos que la cosa se complicaba, el objeto ya está bastante cerca del foco del objetivo y hay que empezar a pensar que nuestro objeto no será una imagen plana, un sello de correos por ejemplo, más bien será una nuez, que tiene un volumen considerable. No todas las partes de la nuez están a la misma distancia del foco de la lente, no todas las imágenes de cada punto de la nuez se forman a la misma distancia. Véase sino la figura, conforme acercamos el objeto al foco, la imagen se forma cada vez más lejos, en este caso mucho más lejos.
Repitamos el dibujo para una lente que enfoca un objeto real, con muchos puntos a considerar (en el dibujo solo dos, por claridad)
Aquí se presenta el problema que ya anunciábamos en macro, los puntos 1 y 2 nos dan las imágenes 1 y 2, en este caso muy separadas al acercarnos al foco de la lente, pero la profundidad de campo no tiene por qué cubrir estos dos puntos y que conste que en el dibujo hemos exagerado, la profundidad de campo NUNCA es así de grande.
Una curiosidad, que tiene explicación matemática que no demostraremos, es que si se analizan los círculos de confusión en los distintos puntos de enfoque, para un diafragma concreto, se comprueba que la profundidad de campo se reparte en un tercio “del objeto hacia la cámara” y dos tercios “del objeto hacia el infinito”. Esto viene dado por lo de “más cerca del foco – más lejos la imagen” y, en los planos de imagen, la profundidad de campo vendría a repartirse según el dibujo, repetimos que exageradamente.
Todo esto sucede igual en una cámara que en un microscopio. En mi cámara, por ejemplo, usando un objetivo de 135 mm y haciendo tomas x2, tengo una profundidad de campo, comprobada, de 1,6 mm. Si hago las fotos con microscopio, por ejemplo en tomas x100, la profundidad de campo se reduce a 15 micras (0,015 mm), vamos, ¡un desastre!
De ahí que cuando se mira con un microscopio no vemos nunca el objeto entero, siempre hay que ir “subiendo y bajando” el foco. En los trabajos de microscopia científica lo normal es mirar láminas extremadamente finas o líquidos prensados entre un portaobjetos y un cubreobjetos, del grueso justo para lo que queramos ver y poder aprovechar al máximo la poca profundidad de campo, además sin posibilidad de variación. Los objetivos de microscopio no incorporan diafragma, son de abertura fija.
En el caso de la documentación que yo practico, me resulta más interesante fotografiar “objetos”, más que “superficies”. El tema que yo trato es más de frutos y semillas, objetos en volumen que pueden llegar a resultar más gruesos que anchos, vamos, que para mí es normal hacer tomas a un fruto con semillas con un volumen de 1x1x1 mm, a una ampliación de x100, con una profundidad de campo real de 0,015 mm (15 micras)
El caso, por ejemplo, de esta semilla de Anagallis tenella. Esta semilla, que se ve en la foto de microscopio ampliada x100 y de la cual presento un esquema de cómo se hizo, tiene escasamente 1 mm, pero es que el microscopio, ampliando x100, me da escasamente 0,015 mm de profundidad de campo.
Para sacar esta foto, con este detalle y esta definición se tomaron 40 planos, separados las 15 micras de rigor, 40×15=600 micras. Aparentemente insuficiente para “cubrir” toda la semilla, pero solo estaba interesado en la parte de semilla “que sale en la foto”, la parte de abajo queda escondida.
Básicamente, con estas explicaciones, queda definida la microscopía de objetos.
La iluminación será una clásica de estudio, la típica “Rembrand con luz lateral”, por ejemplo. Procurar una luz que de algo de volumen al objeto, tal cual se apunta en el dibujo. Teniendo en cuenta que nuestros objetos serán milimétricos, se agradece mucho contar con una fibra óptica que nos facilite dirigir la luz.
Como nota curiosa, solo he sabido resolver bien la toma hasta x200. En el microscopio, cuando quiero hacer ampliaciones x400, el objeto me queda a 0,6 mm del objetivo y “no tengo espacio” para colocar la luz “donde yo quiero”. Esto me está limitando, por ahora, en las fotos de esporas (objetos de muy pocas micras que exigen ampliaciones de x400 o x1000)
El otro colofón necesario a este tema viene determinado por “la calidad mecánica” del microscopio. Ha quedado claro que todo el secreto de la microscopia de volúmenes viene determinado por la posibilidad de ir enfocando por capas de unas pocas micras. Esto implica tener un ajuste de desplazamiento fino sensible y sin resistencia, a la par que preciso micra a micra, un cuerpo de microscopio sólido, pesado, con un mecanizado de precisión, que no vibre en absoluto… En pocas palabras, ¡nada que no se arregle con dinero! De la óptica no hay que preocuparse, cualquier microscopio con buena y cara mecánica aporta una óptica de lujo para nuestras fotos.
Y el último comentario, una vez realizadas las tomas, que recomiendo realizar con la mejor calidad de sensor posible y siempre en formato RAW, para poder aprovechar al máximo todas sus posibilidades, entramos en la parte informática.
No descarto que en el futuro me pueda creer capacitado para escribir sobre el tema. En este momento no soy más que otro aprendiz.
En mi caso, lo primero que hago es revelar los archivos RAW, forzando la claridad y el enfoque de cada una de las tomas. Esto es necesario porque los programas de apilado se basan en seleccionar las partes de cada toma con mayores acutancias, para separarlas y montar un mosaico con ellas… y así elegir cada una de las partes enfocadas de cada una de las capas y presentar una toma única con una profundidad de campo imposible.
A continuación cedo el protagonismo al programa de apilado (yo uso Zerene Stacker, pero puede que haya otros iguales o mejores)
Solo hay un problema con el apilado, cuando se toman las fotos, para enfocar las capas se varía la distancia objeto-objetivo, con lo que cambiamos el tamaño del objeto, de una toma a la siguiente. El programa de apilado recalcula y unifica estas variaciones de tamaño, pero es inevitable que haya algunas superposiciones fallidas. Esto me obliga a recurrir, en último lugar, a un procesador de imágenes, a retocar “fantasmas” que rodean algunas partes de la imagen, y, ya que estamos, a limpiar la toma de puntos residuales, polvo, pelusas, etc.
Por el mismo precio, acabo la foto con un ajuste general de luz, color, contraste y foco, por aquello de dejar una foto “que parezca importante”.
Para un futuro, me gustaría probar un “microscopio confocal”, solo lo conozco de teoría, leído en internet. Pienso que me daría las mismas imágenes, pero bastante más limpias, con foco más definido, con contrastes y superficies más naturales y con menos “fantasmas”. En internet he visto, también, el precio y sospecho que tardaré en probarlo… todo dependerá del futuro del proyecto de Fundación Pep Bonet Capellá y la suerte que pueda tener con mecenas que la apoyen.
Mientras tanto, con la técnica descrita, llevo hechas bastantes cientos de fotografías microscópicas de flores, frutos, semillas, esporangios y alguna espora que han engrosado el archivo botánico… aquello de “pasito a pasito”…
